Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Совместная культивация. Необходимо культивировать неповрежденные и поврежденные клетки отдельно с другими системами клеток, в том числе человеческих клеток и обезьяньих клеток. Следует проводить исследования для выявления возможных морфологических изменений. Тесты проводятся на жидкостях клеточных культур для обнаружения гемагглютинирующих вирусов. Клетки проходят тест, если не обнаружено доказательств наличия какого-либо постороннего вещества.
Ретровирусы. Проверка присутствия ретровирусов осуществляется с помощью использования:
(1) анализов на инфекционность;
(2) трансмиссионной электронной микроскопии;
(3) если тесты (1) и (2) дали отрицательную реакцию, проводится анализ на обратную транскриптазу (в присутствии магния и марганца) на гранулах, полученных высокоскоростным центрифугированием.
10
Тесты на животных. Следует ввести внутримышечно (или, для мышей7 питающихся молоком матери, подкожно) в каждую из следующих групп животных 107 жизнеспособных клеток, разделенных поровну между животными в каждой группе:
(1) два помета детенышей мыши в возрасте менее 24 часов, общим числом не менее 10 животных;
(2) десять взрослых мышей.
Следует ввести интрацеребрально в каждую из десяти взрослых мышей 106 жизнеспособных клеток для обнаружения возможного присутствия вируса лимфоцитарного хориоменингита.
Наблюдение за животными осуществляется в течение минимум 4 недель. Следует также обследовать заболевших животных или животных, у которых наблюдаются аномалии, для определения причины заболевания. Клетки проходят тест, если не обнаружено доказательств наличия какого-либо постороннего вещества. Тест считается недействительным, если менее 80% животных в каждой группе остаются здоровыми и доживают до конца периода наблюдения.
Для клеток, полученных от какого-либо вида грызуна (например, клеток яичников китайского хомяка или клеток почек детеныша хомяка), проводятся тесты на антитела на возможных возбудителей вируса у исследуемого вида. Тесты проводятся на животных, которым вводятся клетки.
Тесты на яйцах. Используя посевной материал в количестве 106 жизнеспособных клеток на каждое яйцо, следует ввести клетки в аллантоисную полость десяти НЗКП куриных яиц с эмбрионами внутри (5.2.2) 9-11-дневного возраста и в желточный мешок десяти НЗКП куриных яиц с эмбрионами внутри 5-6дневной свежести. Выдержать в течение не менее 5 дней. Протестировать аллантоисную жидкость на наличие гемагглютининов, используя эритроциты млекопитающих и птиц; проводить тест при температуре 5 ± 3 °С и 20-25 °С и прочитайте результат через 30 и 60 минут. Клетки проходят тест, если не обнаружено доказательств наличия какого-либо постороннего вещества. Тест считается недействительным, если менее 80 % эмбрионов остаются здоровыми и доживают до конца периода наблюдения.
Тесты на опухолеродность in vitro. Возможно использование следующих систем тестов:
(1) формирование колоний в мягком агаровом геле;
(2) получение инвазивного роста клеток после инокуляции в культуры органов;
(3) исследование трансформационной деятельности с использованием, например, системы анализа 3Т3 для активных онкогенов.
Тесты на опухолеродность in vivo. Тест состоит в сравнительном анализе исследуемой культуры клеток и соответствующим положительным контрольным результатом (например, онкогенных культур HeLa или Hep2).
Системы животных, показавшие себя пригодными для этого теста, включают:
(1) атимичных мышей (генотип Nu/Nu);
(2) новорожденных мышей, крыс или хомяков, подвергшихся действию антитимоцитной сыворотки или глобулина;
(3) облученных мышей с у- да+ленной вилочковой железой, получивших костный мозг от здоровых мышей (Т-, В+).
При выборе любой из систем животных культура клеток и базовые клетки вводятся при помощи инъекций в различные группы живо7тных по 10 животных в каждой. В обоих случаях прививочный материал из 107 клеток в виде взвеси объемом 0,2 мл вводится внутримышечно или подкожно. Новорожденным животным вводится 0,1 мл антитимоцитной сыворотки или глобулина на 0, 2, 7 и 14 день после
11
рождения. Сильнодействующая сыворотка или глобулин подавляет иммунные механизмы растущих животных до уровня, при котором последующее введение 107 положительных базовых клеток регулярно вызывает опухоли и метастазы. Животных, которые сильно поражены и у которых наблюдаются признаки постоянно растущих опухолей, следует убивать, не дожидаясь конца теста, чтобы избежать ненужных страданий.
В конце периода наблюдения всех животных, включая базовые группы, убивают и исследуют на наличие макроскопических и микроскопических признаков разрастания привитых клеток в месте инъекции и в других органах (например, лимфатических узлах, легких, почках и печени).
Во всех тестовых системах животных следует наблюдать и ощупывать через регулярные промежутки времени для обнаружения уплотнений в месте инъекции. Любые сформировавшиеся уплотнения необходимо измерять в двух перпендикулярных измерениях и регулярно записывать эти измерения для того, чтобы определить, наблюдается ли прогрессивный рост уплотнений. Животных, у которых в периоде наблюдения уплотнения начинают уменьшаться, убивают до того, как уплотнения перестанут прощупываться, и подвергают гистологическому исследованию. Животные с прогрессивно растущими уплотнениями наблюдаются в течение 1-2 недель. Половина животных, у которых не наблюдается формирования уплотнений, наблюдается в течение 3 недель, а вторая половина - в течение 12 недель до того, как их убивают и подвергают гистологическому исследованию. Каждое животное подвергается вскрытию, которое включает обследование на предмет макроскопических признаков формирования опухолей в месте инъекции и в других органах, таких как лимфатические узлы, легкие, мозг, селезенка, почки и печень. Все опухолеобразные образования в месте инъекции подвергают гистологическому анализу. Кроме того, так как некоторые культуры клеток могут вызвать метастазы без признаков местного роста опухоли, необходимо провести гистологическое исследование всех обнаруживаемых местных лимфатических узлов и легких животных.
